Szerkesztette: Peter Sarnow, Stanford Egyetem Orvostudományi Kara, Stanford Egyetem, Kalifornia, jóváhagyva 2020. december 25-én (felülvizsgálva 2020. október 25-én)
Beszámolunk az alegységek közötti kölcsönhatásról a koronavírusok-transzkripciós komplexek replikációjában, amelyek elengedhetetlenek a replikációhoz és az evolúciós megőrzéshez.Bizonyítékot nyújtottunk arra, hogy az nsp12-vel kapcsolatos NiRAN domén nukleozid-monofoszfát (NMP) transzferáz aktivitással rendelkezik transzban, és az nsp9-et (RNS-kötő fehérjét) azonosítottuk célpontként.A NiRAN katalizálja az NMP-rész kovalens kapcsolódását a konzervált nsp9 aminoterminálishoz egy olyan reakcióban, amely Mn2+-ionokon és a szomszédos konzervált Asn-maradékokon alapul.Azt találták, hogy a NiRAN aktivitás és az nsp9 NMPiláció elengedhetetlen a koronavírus replikációjához.Az adatok lehetővé teszik, hogy a beágyazott vírus enzimmarker ezen aktivitását összekapcsoljuk azon hipotézis korábbi megfigyeléseivel, hogy az RNS-szintézis beindítása az RNS-vírusok egy osztályában funkcionálisan és evolúciósan konzisztens.
A Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae és 12 másik család) RNS-függő RNS-polimeráza (RdRps) a poliproteinből felszabaduló nem-strukturális fehérje (nsp) amino-terminális (N-terminális) doménjéhez, az úgynevezett NiRAN-hoz kapcsolódik. Az 1ab vírus fő proteázból (Mpro) áll.Korábban a NiRAN-RdRp nsp artériás vírus saját GMPilációs/UMPilációs aktivitásáról számoltak be, és azt javasolták, hogy a nukleozid-monofoszfátnak (NMP) a (jelenleg ismeretlen) vírushoz és/vagy sejt biopolimerizációs dolgokhoz való átviteléhez tranziens generáljon.Itt bemutatjuk, hogy a koronavírus (humán koronavírus [HCoV]-229E és súlyos akut légzőszervi szindróma koronavírus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+-függő NMPilációs aktivitással rendelkezik, amely az nsp9-ből származik az Mpro által közvetített nsp9 képződése után. az N-terminális szegélyező nsps proteolitikusan felszabadul, a foszforamidát az nsp9 N-terminálisán a primer aminhoz (N3825) kötődik.Ebben a reakcióban az uridin-trifoszfát az előnyben részesített nukleotid, de az adenozin-trifoszfát, a guanozin-trifoszfát és a citidin-trifoszfát is megfelelő társszubsztrát.A rekombináns koronavírus nsp9 és nsp12 fehérjéket és genetikailag módosított HCoV-229E mutánsokat használó mutációs vizsgálatok meghatározták a NiRAN által közvetített nsp9 NMPilációhoz és a vírus replikációjához szükséges aminosavakat sejttenyészetben.Az adatok megerősítették a NiRAN aktív hely aminosavainak előrejelzését, és meghatározták az nsp9 N3826 aminosavak fontos szerepét az nsp9 NMPilációban és a vírus replikációjában in vitro.Ez a maradék a konzervált N-terminális NNE tripeptid szekvencia része, és az nsp9 és homológjainak egyetlen invariáns maradékának bizonyult a koronavírus családban.Ez a tanulmány szilárd alapot biztosít más beágyazott vírusok NMPilációs aktivitásának funkcionális vizsgálatához, és lehetséges célpontokat javasol vírusellenes gyógyszerek kifejlesztéséhez.
A Nidovirales pozitív szálú RNS-vírus számos gerinces és gerinctelen állatot fertőz meg (1, 2).A rend jelenleg 14 családot (3) foglal magában, amelyek közül a koronavírus családot az elmúlt 20 évben alaposan tanulmányozták.Abban az időben három zoonózisos koronavírus lépett elő állati gazdaszervezetből, és súlyos légúti fertőzések kitörését okozták az emberekben.Beleértve a súlyos akut fertőző betegségek által okozott tartós világjárványokat.Légzőszervi szindróma Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).A nidovírusok közös genomszervezettel rendelkeznek, és a membránhoz kötött replikációs-transzkripciós komplexum (RTC) alegységét a vírusrészecske 5-β2-terminális kétharmada és a fő szerkezeti alegység kódolja, valamint néhány kiegészítő. .A genom 3??²-es végi harmadában kódolt fehérje (1).A planáris vírusok (Monoviridae) (8) egy családja kivételével minden beágyazott vírus RTC alegységeket kódol két nagy nyitott leolvasási keretben (ORF1a és ORF1b), amelyek a genomiális RNS-ből vannak lefordítva.Az ORF1a a poliproteint (pp) 1a kódolja, az ORF1a és az ORF1b pedig együttesen kódolja a pp1ab-t.Az ORF1a által kódolt fő proteáz (Mpro) általános részvételével mind a pp1a, mind a pp1ab proteolitikusan különböző nem-strukturális fehérjékké (nsps) alakul, más néven 3CLpro, mivel homológiát mutat a picornavírus 3Cpro-jával. 9).Úgy gondolják, hogy ezek az nsp-k egy nagy dinamikus RTC-vé állnak össze, katalizálják a genomiális RNS szintézisét (replikáció) és egy szubgenomikus RNS-készletet (transzkripció), és az ORF1b-től lefelé található ORF expressziójának koordinálására használják (10? ?12).
Az RTC magja tartalmazza az RNS-függő RNS polimerázt (RdRp) (13), az 1. szupercsaládba tartozó helikázt (HEL1) (14, 15) és számos RNS-feldolgozó enzimet, amelyek főként az ORF1b-ben és a koronavírus családban kódolnak. Tartalmazza az nsp12-nsp16 ill. nsp9-nsp12 az Arterioviridae családban (lásd a 10-12 hivatkozást).Az RdRp és a HEL1 a madárfészekvírus két (egyötöde) konzervált doménje, és homológiát mutatnak más RNS-vírusok között.Feltételezhető, hogy a magreplikációt más alegységek segítik, beleértve a pp1a karboxi-terminális (C-terminális) régiójából, az Mpro-tól lefelé felszabaduló kis nsp-ket (koronavírus nsp5 és artériás vírus nsp4).Korlátozott családspecifikus védelemmel és sokrétű tevékenységgel rendelkeznek (áttekintve a 10-12. hivatkozásban).
Viszonylag a közelmúltban egy egyedi szekvencia-motívum-jellemzőkkel rendelkező domént találtak az RdRp melletti amino-terminálison (N-terminálison) minden beágyazott vírusban, de más RNS-vírusokban nem (16).Elhelyezkedése és nukleotid-transzferáz (nukleozid-monofoszfát [NMP] transzferáz) aktivitása alapján ezt a domént NiRAN-nak (Nestvirus RdRp-kapcsolódó nukleotid-transzferáz) nevezik.A NiRAN-RdRp kettős doménes kombinációja a Coronaviridae családban az nsp12-t, az Arterioviridae családban az nsp9-et alkotja, és más nestoviridae-ekben a NiRAN-RdRp várhatóan független nsp-ként szabadul fel a vírus poliproteinjéből.A koronavírusban a NiRAN domén 1/450 maradékot tartalmaz, és a linker régión (16-19) keresztül kapcsolódik a C-terminális RdRp doménhez.Equine Arteritis Vírusban (EAV) (Arteriviridae) a rekombináns nsp9 Mn2+ ionfüggő (önálló) UMPilációs és GMPilációs aktivitást mutat, ami a nestovírusban három konzervált szekvenciabázistól függ, AN, BN és CN. A szekvenciában lévő maradékok.Ahol N a NiRAN-t jelenti) (16).Ezeknek a motívumoknak az N-terminális szegélye egy kevésbé konzervatív preAN motívum.Ezen maradékok egy része a távoli rokon protein-kinázokban is konzervált, ahol kimutatták, hogy részt vesznek a nukleozid-trifoszfát (NTP) megkötésében és a katalitikus aktivitásban (20, 21).Ezzel a megfigyeléssel összhangban a Pseudomonas syringae pszeudokináz SelO számos kulcsfontosságú aktív helye összeállítható a nemrég közzétett SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 szuperkomplexszel.A koronavírus-NiRAN konzervált maradványai az elektron mikrostruktúrában szuperponálva.Rekombináns fehérje (17).Feltételezik, hogy a dokumentált (saját) U/GMPiláció átmeneti állapotot idéz elő az NMP-nek a (jelenleg ismeretlen) szubsztrátra való átviteléhez (16), és a NiRAN és a protein kináz közötti szerkezeti hasonlóság (17, 19) ) A hipotézis, hogy A NiRAN más fehérjéket módosít.
Számos funkció, beleértve a beágyazott vírusokkal való egyedi és egyedi szisztematikus asszociációját és az RdRp-től való genetikai elválasztást, a NiRAN-t ésszerű kulcsfontosságú szabályozó enzimmé teszi a beágyazott vírusok számára, ami kritikus fontosságú azok megjelenése és azonossága szempontjából.Korábban három lehetséges funkciót hívtak meg a NiRAN-nal a genom/szubgenomikus transzláció vagy a replikáció/transzkripció szabályozására.Ha figyelembe vesszük az akkoriban rendelkezésre álló szűkös és hiányos adatokat, minden funkciónak megvannak a maga előnyei és hátrányai (16).Ebben a kutatásban célunk a két nemzetséget képviselő koronavírusok biokémiai és reverz genetikai vizsgálatának ötvözése, eredményeinket pedig a koronavírus család természetes mutációjának evolúciós hátterébe helyezni, hogy betekintést nyerjünk ebbe a titokzatos birodalomba.Jelentős előrelépésekről számolunk be a NiRAN megértésében az RTC-ben található természetes célpontok azonosítása révén, ami (a három rendelkezésre álló hipotézis közül) hozzájárul e tartomány szerepéhez a beágyazott vírus RNS szintézisének megindításában.Ez a kutatás lehetőséget nyit a NiRAN más szerepei számára is a vírusgazda interfészen.
A koronavírus nsp12-vel rokon NiRAN doménjének enzimatikus tulajdonságainak jellemzésére E. coliban előállítottuk a humán koronavírus 229E (HCoV-229E) nsp12 rekombináns formáját, a C-terminálison His6 címkével, és kombináltuk a fehérje [α32-P]-vel Inkubálja együtt NTP-vel MnCl2 jelenlétében az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint.A reakciótermék analízise kimutatta az nsp12-vel együtt vándorló, radioaktívan jelölt fehérje jelenlétét (106 kDa), ami arra utal, hogy a koronavírus nsp12 katalizálja a kovalens fehérje-NMP adduktok képződését, amelyek elsősorban uridin-monofoszfáttal (UMP) képződnek (1A ábra). B).A kvantitatív elemzés azt mutatta, hogy más nukleotidokhoz képest az UMP beépülésének jelintenzitása 2-3-szorosára nőtt (1C. ábra).Ezek az adatok összhangban vannak a koronavírus NiRAN doménjének előre jelzett NMP transzferáz aktivitásával (16), de azt jelzik, hogy a koronavírus és az artériás vírus NiRAN doménjének nukleotid preferenciái eltérőek.
A HCoV-229E nsp12 ön-NMPilációs aktivitása.(A) A HCoV-229E nsp12-His6-ot (106 kDa) a kijelölt [α-32P] NTP-vel inkubáltuk 6 mM MnCl2 jelenlétében 30 percig (a részletekért lásd az Anyagok és módszerek részt).A reakciótermékeket SDS-PAGE-val választottuk el, és Coomassie briliánskékkel festettük.(B) A radioaktívan jelölt fehérjét foszforos leképezéssel tettük láthatóvá.Az nsp12-His6 és a fehérje molekulatömeg-markerek helyzetét (kilodaltonban) az A és B mutatja. (C) A radioaktív jel intenzitását (átlag ± SEM) három független kísérletből határoztuk meg.*P≤0,05.A jelerősség (százalék) az UTP-hez kapcsolódik.
Bár a NiRAN-nal kapcsolatos enzimaktivitásokról kimutatták, hogy elengedhetetlenek az EAV és a SARS-CoV sejtkultúrában történő replikációjához (16), a specifikus NiRAN funkciót és a lehetséges célpontokat még nem határozták meg.A közelmúltban jelentett szerkezeti hasonlóság a NiRAN és a protein-kináz-szerű ráncokkal rendelkező fehérjék családja között (17, 22) arra késztetett bennünket, hogy teszteljük azt a hipotézist, hogy a NiRAN katalizálja más fehérjék NMPilációját.Létrehoztunk egy sor potenciális homológ célpontot, beleértve a HCoV-229E ORF1a által kódolt nem strukturális fehérjéket (nsps 5, 7, 8, 9, 10), amelyek mindegyike tartalmaz egy C-terminális His6 címkét (SI függelék, S1 táblázat). inkubálja ezeket a fehérjéket [α32-P] uridin-trifoszfáttal ([α32-P]UTP) nsp12 jelenlétében vagy hiányában.Az E. coliban termelt szarvasmarha szérumalbumin és MBP-LacZα fúziós fehérje szolgált kontrollként (2A. ábra, 1-7. sáv).A radioaktívan jelölt fehérjét nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) és autoradiográfiával elemeztük, és azt találtuk, hogy az nsp12-t és nsp9-et tartalmazó reakcióban erős radioaktív jel volt.A jel helyzete megfelel az nsp9 molekulatömegének, ami az nsp9 nsp12 által közvetített UMPilációját jelzi (2B. ábra, 7. sáv).Más tesztfehérjéket nem találtunk UMPiláltnak, ami arra a következtetésre vezetett, hogy az nsp9 az nsp12 specifikus szubsztrátja.Az 1. ábrán látható ön-NMPilációs adatokkal összhangban az nsp12 képes mind a négy NMP-t átvinni az nsp9-be, bár a hatékonyság eltérő, UMP> adenozin-monofoszfát (AMP)> guanozin-monofoszfát (GMP)> citidin-monofoszfát (CMP)) ( Kép).3 A és B).Az ebben a vizsgálatban alkalmazott körülmények között (a reakció- és expozíciós idő lerövidítése, az nsp12 koncentrációjának csökkentése; anyagok és módszerek) nem lehetett kimutatni az nsp12 ön-NMPilációját (vö. 2B. ábra, 7. sáv és 1B. ábra), ami hatékonynak bizonyult (és több körben) az UMP nsp12-ről nsp9-re került.Az UMP-transzferáz aktivitáshoz Mn2+-ionok jelenléte szükséges, amint az a 3C. ábrán látható, míg Mg2+ jelenlétében csak minimális UMP-transzferáz aktivitást figyeltünk meg, a másik két vizsgált kétértékű kation jelenlétében pedig nem.Hasonló adatokat kaptunk a citidin-trifoszfátot (CTP), guanozin-trifoszfátot (GTP) és adenozin-trifoszfátot (ATP) tartalmazó NMPilációs tesztekben (SI függelék, S1 ábra).
Az nsp9 HCoV-229E nsp12 által közvetített UMPilációja.Egy sor fehérje szubsztrátot (beleértve a szarvasmarha szérumalbumint, az MBP-lacZα-t és az ORF1a által kódolt C-terminális His6-tal jelölt HCoV-229E nsps-t) használtunk a HCoV-229E nsp12-His6⁺ által közvetített UMPilációs aktivitásának értékelésére. fehérje.Inkubálja a fehérjét [α-32P] UTP-vel 10 percig nsp12 hiányában (A) vagy jelenléte (B) az anyagokban és módszerekben leírtak szerint.Az A és B tetején Coomassie Brilliant Blue-val festett SDS-poliakrilamid gél, az A és B alján pedig a megfelelő autoradiogramok láthatók.A fehérje molekulatömeg-marker pozíciója (kilodaltonban) a bal oldalon látható.Az nsp12-His6 helyzete (B, felül) és az nsp12-His6 nsp9-His6-tal való inkubációja során megfigyelt radioaktív jel (B, 7. sáv) szintén feltüntetésre kerül, ami azt jelzi, hogy az [α-32P]UMP az nsp9-His6-hoz (12,9 kDa), amit más vizsgált fehérjéknél nem figyeltek meg.
Az nsp9 NMPiláció HCoV-229E NiRAN-közvetített biokémiai és virológiai jellemzése.(A és B) A reakcióban használt nukleotid-koszubsztrát szerepe.Az Nsp12-His6-ot és az nsp9-His6-ot összekeverjük és különböző [α-32P] NTP-k jelenlétében inkubáljuk a standard NMPilációs vizsgálatban.(A, felül) Coomassie-festett nsp9-His6 SDS-PAGE-val elválasztva.(A, alsó) A gél azonos területének autoradiográfiája.(B) A relatív aktivitást (átlag ± SEM) a kijelölt nukleotid-kofaktor jelenlétében három független kísérletből határozzuk meg.*P≤0,05.(C) A fémionok szerepe.Az ábrán a standard NMPilációs teszt látható [α-32P] UTP és különböző fémionok jelenlétében, mindegyik 1 mM koncentrációval.A C-ben a felső, Coomassie-festett nsp9-His6 látható, a C-ben pedig az alsó része a megfelelő autoradiográfia látható.A jelölt fehérje mérete (kilodaltonban) az A-tól és C-től balra látható. (D) A HCoV-229E nsp12-His6 mutáns formája, amely a megadott aminosav-szubsztitúciót hordozza, az [α-32P]UTP-ben található, a leírás szerint az Anyagok és módszerek c.Az NMPilációs reakcióban keletkező, radioaktívan jelölt nsp9-His6-ot foszforilációs képalkotással detektáljuk (D, fent).A vad típusú (wt) fehérjéhez viszonyított relatív aktivitást a D mutatja, és az alsó értéket három független kísérlet átlagának (±SEM) vettük.A csillagok a nem konzervált maradékok helyettesítését jelzik.(E) A fertőzés után 24 órával nyert p1 sejtek tenyészet felülúszójában a vírustitert plakk vizsgálattal határoztuk meg.A módosított HCoV-229E mutáns NiRAN doménjében lévő kodonszubsztitúciók vannak feltüntetve (a csoportok számozása a pp1ab-ban lévő pozíciójukon alapul).Kontrollként a replikáció-hiányos RdRp aktív hely mutánst, az nsp12_DD4823/4AA-t használtuk.
A NiRAN aktív helyének mélyebb megismerése és az nsp9-specifikus NMP-transzferáz aktivitásával kapcsolatos aminosavak meghatározása érdekében mutációs elemzést végeztünk, melynek során a NiRAN AN, BN és CN motívumokban lévő konzervatív aminosavakat helyettesítettük ( 16) Ala (SI függelék, S2 ábra).Ezenkívül két esetben értékelték a konzervatív Arg-to-Lys vagy Lys-to-Arg szubsztitúciók hatását.(Negatív) kontrollként a koronavírusok és más beágyazott vírusok NiRAN doménjében nem vagy kevésbé konzervált aminosavakat Ala helyettesíti. A K4116A (preAN motívumban), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motívum) helyettesíti. BN) és D4280A (CN) szignifikánsan csökkenti, vagy akár ki is küszöböli az nsp9 NMPilációt az nsp12-n keresztül, míg a konzervatív szubsztitúciójú fehérjék (R4178K , K4116R) megtartják aktivitásuk 60%-át és 80%-át, ami azt jelzi, hogy a korlátozások lazítása saját oldalukon láncok fizikai-kémiailag érzékenyek (3D. ábra).Számos más konzervált E4145A, D4273A, F4281A és D4283A maradék cseréje sokkal kevésbé káros, és az nsp9 UMPylációja csak mérsékelten csökken.Hasonló eredményeket kaptunk más NTP-ket is érintő nsp9 NMPilációs reakciókban (3D ábra és SI függelék, S3 ábra), megerősítve, hogy a specifikus aminosav-szubsztitúciókra gyakorolt megfigyelt hatások függetlenek a használt nukleotid-koszubsztrát típusától.Ezután megvizsgáltuk ezen nsp12 szubsztitúciók lehetséges hatását a koronavírusok sejtkultúrában történő replikációjára.Ebből a célból megfelelő, genetikailag módosított komplementer DNS (cDNS) templátokat használtunk, amelyeket rekombináns vaccinia vírusba klónoztak (23, 24) 5-7 sejtek átírására.Az ezekben a sejtekben termelt fertőző vírusutódok titrálása azt mutatta, hogy a legtöbb HCoV-229E NiRAN mutáns nem volt megvalósítható (3E. ábra).A nem életképes vírusmutánsok egy csoportja olyan alternatívákat tartalmaz, amelyekről kimutatták, hogy megszüntetik vagy jelentősen csökkentik az NMP transzferáz aktivitását in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), de van még két alternatíva (K4116R, E4045A). % foglalt?In vitro NMPilációs aktivitásuk további korlátozásokra utal.Hasonlóképpen, két másik mutáció (R4178K, F4281A), amelyek mérsékelten csökkentették a NiRAN in vitro NMPilációs aktivitását, élő vírusokat termeltek, azonban ezek a vírusok jelentősen csökkentették a titereket a replikáció révén.A 3D. ábrán látható in vitro aktivitási adatokkal összhangban a koronavírusban és/vagy más beágyazott vírusokban (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) nem konzervált négy másik maradék pótlása életképes vírusokat termelt. mérsékelten csökkent titer a vad típusú vírushoz képest (3E. ábra).
Annak vizsgálatára, hogy a NiRAN által közvetített NMP transzferáz aktivitás függ-e az aktív RdRp doméntől, az RdRp C motívumában a kétértékű fémionok koordinációjában részt vevő két konzervált Asp-maradékot (11) Ala-ra cseréltük. A kapott fehérje nsp12_DD4823/4AA megmarad. nsp9 NMPilációs aktivitása, ami azt jelzi, hogy az nsp12 által közvetített in vitro nsp9 NMPilációs aktivitáshoz nincs szükség polimeráz aktivitásra (SI Függelék, S4 ábra).
Miután megállapítottuk az nsp12 nsp9-specifikus NMP transzferáz aktivitását, megpróbáltuk jellemezni az NMP-nsp9 adduktot tömegspektrometriával (MS).A rekombináns HCoV-229E nsp9 teljes fehérje tömegspektruma 12 045 Da-nál mutatott csúcsot (4A. ábra).Az nsp12 hozzáadása nem változtatta meg az nsp9 minőségét, ami azt jelzi, hogy az nsp12 és nsp9 nem képez stabil komplexet az alkalmazott körülmények között (denaturáció) (4A ábra).UTP és GTP jelenlétében az nsp9-et és nsp12-t tartalmazó reakció tömegmérése azt mutatta, hogy az UTP fehérjetömege 306 Da-t, a GTP fehérjetömege pedig 345 Da-t, ami azt jelzi, hogy minden nsp9-molekula köt egy UMP-t vagy GMP-t. (4. kép) C és D).A feltételezések szerint a NiRAN által közvetített nsp9 NMPilációhoz szükséges energia az NTP hidrolíziséből és pirofoszfát felszabadulásából származik.Noha ebben a reakcióban az nsp9-et (célpont) 10-szeres moláris feleslegben alkalmaztuk, mint az nsp12-t (enzim), az nsp9 szinte teljes NMP-leződését figyelték meg, ami azt jelzi, hogy az nsp12 és nsp9 közötti kölcsönhatás rövid életű, és az nsp12 több nsp9-et képes NMP-leálni. in vitro molekula.
Az nsp9 egyszeri NMPilációja nsp12 és UTP vagy GTP jelenlétében.Az ábrán a HCoV-229E nsp9 dekonvolúciós teljes fehérjetömegspektruma látható (SI függelék, S1 táblázat) (AD).(A) nsp9 önmagában, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP jelenlétében, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP jelenlétében.
Az nsp12-vel UMPilált nsp9-maradékok meghatározásához az nsp9-UMP-t tripszinnel hasítottuk.A kapott peptideket nano-nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) választottuk el, és tandem tömegspektrometriával (MS/MS) online elemeztük.A Byonic szoftvercsomaggal (Protein Metrics) végzett adatelemzés az N-terminális aminosav UMPilációját mutatta.Ezt manuálisan kell megerősíteni.Az [UMP]NNEIMPGK prekurzor peptid tandem tömegspektruma (SI függelék, S5A ábra) egy fragmentumot mutatott ki 421 m/z-nél, ami azt jelzi, hogy az UMP az nsp9 1. oldalláncához kötődik.
Az nsp9 N-terminálisán az Asn megőrződött az Orthocoronavirinae tagjai között (SI függelék, S6 ábra).Bár úgy gondoljuk, hogy az N-terminális primer amin nitrogénje a legvalószínűbb akceptor az UMP számára, úgy döntöttünk, hogy további bizonyítékokat szerezzünk az NMP-kötődésre az N-terminálison.Emiatt a HPLC-vel tisztított, nem NMP-ezett és NMP-lezett N-terminális peptidet nsp9 aceton és nátrium-ciano-bór-hidrid jelenlétében állítottuk elő.Ilyen körülmények között csak a szabad primer aminok módosíthatók propil-csoporttal (25).Az NNEIMPGK szekvenciájú N-terminális nsp9-eredetű peptid két primer amint tartalmaz, az egyiket az Asn N-terminálisán, a másikat a Lys oldalláncán a C-terminálison.Ezért a propilcsoportok mindkét végén bevihetők.A nem NMPilezett peptidek extrahált ionkromatogramja az SI függelékben, az S5B ábrán látható.Ahogy az várható volt, az N-terminális és C-terminális (mono)propilezett (SI függelék, S5B ábra, felső sáv) és dipropilezett peptidek (SI függelék, S5B ábra, alsó sáv) azonosíthatók.Ez a mintázat megváltozik az nsp9 NMPilált N-terminális peptidjének használatával.Ebben az esetben csak a C-terminális propilált peptidek azonosíthatók, de az N-terminális propilált peptidek és dipropilezett peptidek nem azonosíthatók (SI Függelék, S5C ábra), ami azt jelzi, hogy az UMP átkerült az N-terminális primer aminba Ennek megakadályozása érdekében csoport ne hajtson végre változtatásokat.
Ezután lecseréljük (Ala vagy Ser-re) vagy töröljük az nsp9 N-terminálisán lévő konzervált maradékokat, hogy meghatározzuk a célspecifikus megszorításokat.MS adataink alapján, amelyek azt mutatják, hogy a NiRAN nsp9-NMP adduktot képez az nsp9 N-terminális aminosavának primer aminjával, feltételeztük, hogy az nsp9 NMPilációhoz a virális mesterproteáz (Mpro, nsp5) szükséges az nsp9 N-terminális felszabadításához. poliprotein prekurzora.Ennek a hipotézisnek a tesztelésére nsp9-et tartalmazó nsp7-11 prekurzor fehérjét állítottunk elő E. coliban, és standard NMPilációs tesztet végeztünk [α-32P] UTP jelenlétében (anyagok és módszerek).Amint az 5A. ábrán (3. sáv) látható, a vágatlan nsp7-11 prekurzor nincs radioaktívan jelölve nsp12-vel.Ezzel szemben, ha az nsp7-11-et a rekombináns nsp5 hasítja, hogy az nsp9 (és más nsp-k) felszabaduljon a prekurzorból, egy radioaktívan jelölt fehérjét detektálunk, amely nsp9-cel együtt vándorol, ami megerősíti azt a következtetésünket, hogy a NiRAN és az N-szelektív kovalens nsp9-NMP adduktumok képződése. .Az N-terminális Asn terminális primer aminja (3825. pozíció a pp1a/pp1ab-ban).Ezt a következtetést az nsp9 konstrukcióval végzett kísérletek is alátámasztják, amely egy vagy két további aminosavakat tartalmaz az N-terminálison.Mindkét esetben az nsp9 NiRAN által közvetített UMPilációja megszűnt (SI Függelék, S7 ábra).Ezt követően olyan fehérjét állítottunk elő, amelyből egy vagy két Asn-maradékot töröltünk a 3825-NNEIMPK-3832 peptidszekvenciából az nsp9 N-terminálisán.Mindkét esetben az nsp9 UMPiláció teljesen blokkolt volt (5B. ábra), ami további bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a valódi nsp9 N-terminális NMP-receptorként működik.
Az nsp9 proteolitikus feldolgozása és az N-terminális aminosavak szerepe az nsp12 által közvetített UMPilációban.(A) Az nsp9 UMPilációhoz szabad nsp9 N-terminálisra van szükség.Az Nsp7-11-His6-ot 30 °C-on előinkubáljuk UTP-t tartalmazó NMPilációs detektáló pufferben, rekombináns Mpro (nsp5-His6) jelenlétében vagy hiányában.3 óra elteltével indítsa el az NMPilációs vizsgálatot nsp12-His6 hozzáadásával az Anyagok és módszerek részben leírtak szerint.Kontrollként az nsp5-His6-ot (1. sáv) és nsp9-His6-ot (2. sáv) tartalmazó reakciót használtuk.10 perc elteltével a reakciót leállítjuk, és a reakcióelegyet SDS-PAGE-val elválasztjuk.A fehérjét Coomassie Brilliant Blue-val (A, felül) festettük.Az Nsp7-11-His6 prekurzor és az nsp5-His6 által közvetített hasításból származó feldolgozott termék a jobb oldalon látható.Kérjük, vegye figyelembe (kis méretük miatt), hogy az nsp7 és az nsp11-His6 nem detektálható ebben a gélben, és a reakciót nsp5-His6-tal egészítik ki (1. és 4. sáv; az nsp5-His6 helyzetét egy folytonos kör jelzi) vagy az nsp9-His6 (2. sáv) kis mennyiségű MBP-t (nyílt körökkel jelölve) tartalmaz maradék szennyeződésként, mivel MBP fúziós fehérjeként fejeződnek ki (SI függelék, S1 táblázat).(B) Az Nsp9-His6 variánsból hiányzik egy vagy két N-terminális Asn-maradék (a csoportok számozása a pp1a/pp1ab-ban elfoglalt pozíció szerint), és megtisztítják és nsp12-His6-tal és [α-32P] UTP-vel inkubálják.B, Coomassie-val festett SDS-PAGE látható felül, B, a megfelelő autoradiográf lent látható.A molekulatömeg-marker pozíciója (kilodaltonban) a bal oldalon látható.(C) A HCoV-229E nsp9-His6 N-terminális konzervált aminosavait Ala-val vagy Ser-vel helyettesítettük, és ugyanannyi fehérjét használtunk az nsp12-His6 által közvetített UMPilációs reakcióban.A reakciótermékeket SDS-PAGE-val elválasztottuk és Coomassie Brilliant Blue-val festettük (C, felül), és a radioaktívan jelölt nsp9-His6-ot foszforeszcencia leképezéssel detektáltuk (C, középen).A vad típusú (wt) fehérjét referenciaként használva (100%-ra állítva), a relatív NMPilációs aktivitást (átlag ± SEM) három független kísérletből számítottuk ki.(D) A HCoV-229E vad típusú Huh-7 sejtekkel fertőzött Huh-7 sejtek és az nsp9-ben meghatározott aminosav szubsztitúciót hordozó mutánsok p1 sejttenyészet felülúszójában a vírustitereket plakk vizsgálattal határoztuk meg.A replikáció-hiányos RdRp C-motívum kettős mutáns DD4823/4AA-t használtuk negatív kontrollként.
Az nsp9 N-terminálisa (különösen az 1., 2., 3. és 6. pozíció) nagyon konzervált az Orthocoronavirinae alcsalád tagjai között (SI függelék, S6 ábra).Annak érdekében, hogy tanulmányozzuk ezeknek a csoportoknak az nsp12 által közvetített nsp9 NMPilációban betöltött lehetséges szerepét, az nsp9 N-terminálisán két egymást követő Asn-maradékot Ala vagy Ser-re cseréltünk (önmagában vagy kombinációban).A vad típusú nsp9-hez képest az N3825 Ala vagy Ser-re cserélése több mint kétszeres csökkenést eredményezett az nsp12 által közvetített UMPilációban (5C. ábra).Következtetésünknek megfelelően, miszerint az NMPiláció az N-terminális primer aminnál történik az N-terminális oldallánc helyett, jelentős maradék NMPilációt figyeltünk meg az N3825A és N3825S helyettesítésével.Érdekes módon, ha a második Asn-t Ala vagy Ser helyettesíti, az nsp9 UMPilációja erősebben (több mint 10-szeresére) csökken, míg az Ala 3-as, 4-es és 6-os pozícióban történő cseréje csak mérsékelt hatással van az nsp9 UMPilációjára (2. ábra). ) .5C).Hasonló eredményeket kaptunk ATP, CTP vagy GTP használatával (SI függelék, S8 ábra).Ezek az adatok együttesen jelzik az N2826 kulcsszerepét (2. pozíció az nsp9-ben) az nsp9 NMPilációban.
Annak érdekében, hogy további bizonyítékokat szerezzünk az nsp9 N-terminálisa és az NMPiláció közötti funkcionális korrelációról, elvégeztük a Coronavirus család nsp9 szekvenciájának többszörös szekvencia illesztését (MSA), amely 104 és 113 aminosav között változik (SI függelék, ábra). S6).Összességében az Orthocoronavirinae alcsalád 5 nemzetségének 47 (ismert és feltételezett) fajában, amelyek különböző emlősöket, madarakat és hüllőket fertőznek meg, összesen mindössze 8 maradványt találtak invariánsnak.A legkiterjedtebb változások, beleértve a deléciókat és inszerciókat, az nsp9 másodlagos szerkezeti elemei közötti ciklusokban figyelhetők meg, a korábbi szerkezeti vizsgálatok alapján (26 ± 28).Öt invariáns maradékot találtunk az nsp9 C-terminális részének β-szálában és α-hélixében.Három invariáns aminosav alkotja az nsp9 N-terminálisának NNE-motívumát.Kiderült, hogy ennek a motívumnak a második Asn-je az egyetlen invariáns maradék, amelyet a távoli rokon béka koronavírus hipotetikus nsp9-je is megoszt, és a Microhyla letovirus 1 fajt képviseli az Alphaletovirus Letovirinae alcsaládjában.Az nsp9 másodlagos szerkezeti elemeiben lévő maradékok konzerválása szerkezeti megfontolásokkal racionalizálható, hogy fenntartsák a hajtogatási vagy ismert RNS-kötő tulajdonságokat.Úgy tűnik azonban, hogy ez az érvelés nem vonatkozik az NNE konzerválására, és e tanulmány előtt a tripeptid szekvencia variációját korlátozó megszorítások természete teljesen homályos volt.
Annak érdekében, hogy meghatározzuk az nsp9-NMPiláció és az NNE konzerváció jelentőségét a koronavírus replikációjában, HCoV-229E mutánsokat állítottunk elő, amelyek az nsp9 N-terminális aminosavak egyszeri vagy kettős szubsztitúcióját hordozzák, jelezve, hogy az nsp9 NMPiláció káros in vitro.Mielőtt elkezdenénk, megpróbáljuk megválaszolni azt a kérdést, hogy ezek a szubsztitúciók (az nsp8|9 hasítási hely közelében) befolyásolják-e a C-terminális pp1a régió proteolitikus feldolgozását.Az nsp9 N-terminálisán megfelelő szubsztitúciókat tartalmazó nsp7-11 poliprotein konstrukciók sorozatát állítottuk elő E. coliban, és rekombináns Mpro-val hasítottuk.A négy hely proteolitikus hasítását (beleértve az nsp9 szegélyező helyet is) nem befolyásolja szignifikánsan semmilyen bevezetett szubsztitúció (SI függelék, S9 ábra), kivéve ezeknek a fehérjéknek a szerkezeti változásait, amelyek megzavarják az Mpro-közvetített nsp8|9 hasítást (vagy más) weboldal.
A Huh-7 sejteket genomhosszúságú HCoV-229E RNS-sel transzfektáltuk, amely Ala vagy Ser szubsztitúciókat kódolt a konzervált NNE tripeptidekben (N3825, N3826 és E3827) az nsp9 N-terminálisán, ami azt mutatja, hogy a mutációk többsége végzetes.Sikerült megmenteni a vírust az N-terminális Asn Ser vagy Ala pótlásával (N2835A vagy N2835S), de nem sikerült visszanyerni a vírust az NNE szekvencia más egyszeres és kettős mutációival (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (5D. ábra).
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a koronavírusok replikációja a szövettenyészetben korlátozott (ugyanolyan vagy hasonló), ami korlátozza az nsp9 NMPilációs helyek természetes mutációját a szervezetben, és alátámasztja ennek a válasznak a kulcsszerepét a koronavírusok életciklusában.
Az utolsó kísérletsorozatban a C-terminális His6-tal jelölt SARS-CoV-2 nsp12-t és nsp9-et, valamint az nsp12 két mutáns formáját állítottuk elő E. coliban.A NiRAN és RdRp domének aktív helyei az Ala helyett (6A ábra és SI függelék, S2 táblázat).A K4465 a SARS-CoV-2 nsp12-ben a K4135-nek felel meg a HCoV-229E-ben (SI Függelék, S2 ábra), amely szükségesnek bizonyult a NiRAN aktivitáshoz és a HCoV-229E replikációjához (3D és E ábra).Ez a maradék megfelel az artériás vírus EAV nsp9 K94 maradékának is, amelyről korábban kimutatták, hogy szükséges a NiRAN ön-UMPilációjához/ön-GMPilációjához (16).Amint a 6B. ábrán látható, a SARS-CoV-2 nsp12 UMP transzferáz aktivitással rendelkezik, szubsztrátként nsp9-et használva, míg az nsp12_K4465A aktív hely mutáns inaktív.Az RdRp C-motívum SDD jellegzetes szekvenciájának kettős szubsztitúciója nem befolyásolja az UMP transzferáz aktivitást (6B. ábra), ami azt jelzi, hogy az RdRp aktivitásnak nincs közvetlen hatása az nsp9 UMPilációra.Hasonló adatokat kaptunk CTP, GTP és ATP használatával (SI függelék, S10 ábra).Összefoglalva, ezek az adatok azt mutatják, hogy a NiRAN által közvetített nsp9 NMPiláció konzervatív aktivitással rendelkezik az ortokoronavírus alcsalád különböző nemzetségeit képviselő koronavírusokban.
A SARS-CoV-2 nsp12 által közvetített nsp9 NMPilációja.(A) Coomassie festett SDS-poliakrilamid gél, amely az NMPilációs tesztben használt rekombináns fehérjét mutatja.Kontrollként a SARS-CoV-2 nsp12 NiRAN doménjében (K4465A) és RdRp doménjében (DD5152/3AA) aktív helyszubsztitúciójú mutáns fehérjét használtunk.A maradékok számozása a pp1ab-ban lévő pozíción alapul.(B) Az UMPiláció detektálásának autoradiográfiája nsp9-His6 és [α-32P]UTP felhasználásával az nsp12-His6 (vad típusú [wt] és mutáns) szubsztrátjaként.A jelölt fehérje molekulatömege (kilodaltonban) a bal oldalon látható.
A NiRAN domének általában konzerváltak a Nidoviralesben (16), ami azt jelzi, hogy katalizálják a Nidovírus replikációjához nélkülözhetetlen enzimreakciókat.Ebben a tanulmányban be tudtuk bizonyítani, hogy a koronavírus NiRAN doménje átviszi az NMP-t (NTP-ből) az nsp9-be, egy titokzatos RNS-kötő fehérjébe, amely részt vesz a vírus replikációjában (26 ?? 29 ), hogy meghatározza azt természetes célpontként és a koronavírus RTC partnere.
A NiRAN domén három szekvencia-motívummal rendelkezik (AN, BN és CN), amelyek nagyon kis számú olyan maradékot tartalmaznak, amelyek minden családban konzerváltak a monofiletikus, de erősen differenciált Nidovirales rendben (8, 16).A közelmúltban végzett vizsgálatok kimutatták, hogy szerkezetileg rokonságban állnak a protein-kináz-szerű fehérjék egy nagyrészt nem jellemzett családjával, amelyet eredetileg SelO családnak neveztek (17, 19, 22, 30, 31).A SelO-val rokon fehérjéknek kinázredői vannak, de hiányzik belőlük néhány konzervált aktív hely a klasszikus kinázokban (22, 32).Az aktív helyhez kötött és specifikus kölcsönhatásokkal stabilizált ATP-molekulák fordított orientációja alapján feltételezték, hogy a SelO (foszfát helyett) AMP-t visz át a fehérje szubsztrátba (22), míg egy másik bakteriális SelO-szerű fehérje, az YdiU. a közelmúltban kimutatták, hogy katalizálja az UMP kovalens kötődését a különböző fehérjeszubsztrátok Tyr- és His-maradékaihoz (33).
A koronavírus NiRAN doménjének feltételezett aktív hely maradékaira vonatkozó előrejelzés megerősítése és bővítése érdekében biokémiai és reverz genetikai módszereket alkalmaztunk a koronavírus nsp12 mutációanalíziséhez (3D és E ábra és SI függelék, S3 ábra és táblázat) S1â S4).Az adatok azt mutatják, hogy a HCoV-229E K4135, R4178 és D4280 helyettesítése Alával megszünteti az in vitro NMP transzferáz aktivitást és a vírus replikációját a sejttenyészetben (3D és E és SI függelékek, S3 ábra), alátámasztva jelenlétüket az NTP γ-foszfátban (K4135, R4178) és az aktív hely fémionok koordinációja (D4280).A konzervált Glu E4145A szubsztitúciója a madárfészek vírus tartományában, amelyről azt feltételezték, hogy stabilizálja a K4135 (17) pozíciót, kimutatták, hogy kiküszöböli a vírus replikációját, de meglepő módon az aktivitás megmaradt az in vitro NMPilációs vizsgálatban (3D és E ábra, ill. SI függelék, S3 ábra és S1–S4 táblázatok).Hasonló megfigyelés történt, amikor a megfelelő szubsztitúciót bevezették a Salmonella typhimurium (E130A) YdiU homológjába (33).Összességében ezek az adatok a konzervált maradék szabályozó funkcióját támasztják alá, nem pedig a katalitikus funkciót.
A konzervált Phe-maradék (F4281A) cseréje a nestovírus tartományában a HCoV-229E NiRAN doménjében (8) az NMPilációs aktivitás csökkenését eredményezte in vitro, és jelentősen csökkentette a vírus replikációját sejttenyészetben (3D, E és SI ábra) függelék, S3 ábra).Az adatok összhangban vannak ennek a maradéknak a fontos szabályozó funkciójával, például a korábban bemutatott homológ DFG-motívum Phe-maradékával.A klasszikus protein kinázokban az Mg2+-kötő hurok része, és segíti a gerinc összeállítását és szabályozását???A hatékony katalitikus aktivitáshoz szükséges (32, 34).A K4116 aminosavak Ala és Arg helyettesítése (a preAN motívumban) megszüntette a vírus replikációját, és a várakozásoknak megfelelően eltérő hatást gyakorolt az NMP transzferáz aktivitására in vitro, a bevezetett aminosav oldallánctól függően (3D ábra, valamint E és SI függelékek). , S3 ábra).A funkcionális adatok összhangban vannak a szerkezeti információval, ami azt jelzi, hogy ez a maradék kölcsönhatást létesített az ATP-foszfáttal (17).Más beágyazott víruscsaládok NiRAN doménjében a HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 pozícióját Lys, Arg vagy His (8) foglalja el, ami azt jelzi, hogy ennek a specifikus csoportnak a funkcionális korlátozása enyhült.A D4188A és D4283A szubsztitúciója megszünteti vagy erősen csökkenti az enzimaktivitást, és megszünteti a vírus replikációját (3. ábra).Ez a két maradék a legtöbb (de nem az összes) beágyazott vírusban megőrződött (8), ami fontos családspecifikus, de valószínűleg nem katalitikus funkciót jelez.Számos más Lys és Asp (K4113A, D4180A, D4197A és D4273A) ala szubsztitúcióját használták, amelyek nem konzerváltak a Coronaviridae vagy más Nestioviridae családokban (8).Ahogy az várható volt, ezek a szubsztitúciók nagyrészt tolerálhatók, bizonyos esetekben az enzimaktivitás és a vírusreplikáció enyhe csökkenésével (3. ábra és SI függelék, S3 ábra).Összességében a koronavírus mutagenezis adatai nagyon összhangban vannak az EAV NiRAN-RdRp (16) saját-GMP és reverz genetikai adataival, amelyben az EAV nsp9 (koronavírus nsp12 ortológ) K94 (a HCoV-229E K4135-nek megfelelő) aminosavnak fontos szerepe van. R124 (R4178-nak), D132 (D4188-nak), D165 (D4280-nak), F166 (F4281-nek).Ezenkívül a HCoV-229E mutagenezis adatai összhangban vannak a korábban közölt SARS-CoV reverz genetikai adatokkal, és azokból kibővültek (16), és nagyon hasonlóak a megfelelő CN-motívum Phe-to-Ala mutáns SARS-CoV_nsp12 adataihoz. leírt fenotípus -F219A és HCoV-229E_F4281A (3. ábra D és E és SI függelék, S3 ábra és S1-S4 táblázat).
Az EAV ortológokkal (16) összevetve, amelyek egyértelműen preferálják az UTP-t és a GTP-t (az ön-NMPilációs reakcióban), tanulmányunk azt mutatja, hogy a koronavírus NiRAN-doménje (amelyet a HCoV-229E és a SARS-CoV-2 képvisel) hatékonyan alkalmazható. Mind a négy NMP átkerült, bár az UMP-t enyhén preferálják (1. és 3. ábra).A specifikus NTP-társszubsztrát viszonylag alacsony specificitása összhangban van a közelmúltban közölt SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 szuperkompozit szerkezettel, amelyben az ADP-Mg2+ kötődik a NiRAN aktív helyéhez, de nem kötődik az adenin részhez. specifikus kölcsönhatások kialakulásáról (17).Vizsgálatunkban az NMPilációs reakcióban használt nukleotid típusának nincs különbsége a mutáns fehérje aktivitására (SI Függelék, S3 ábra), ami azt jelzi, hogy ezen aminosavak egyike sem kapcsolódik szorosan egy specifikus nukleobázis kötődéséhez.A koronavírusok és az artériás vírusok NiRAN doménjében megfigyelt különböző NTP társszubsztrát preferenciák szerkezeti alapja és lehetséges biológiai jelentősége még tanulmányozásra vár;igazak lehetnek, vagy a vonatkozó tanulmányaik korlátai miatt.Jelenleg nem zárható ki, hogy az artériás vírus NiRAN doménjének potenciális NMPilátor aktivitása (a korábban jellemezhető ön-NMPilációs aktivitáshoz képest) eltérő társszubsztrát preferenciával rendelkezik, figyelembe véve, hogy az artériás és a koronavírus hasonlósága A NiRAN domain a határon van.Sorozat alapú összehasonlítás (16).A Mg2+-t kofaktorként használó SelO pszeudokinázhoz képest a koronavírus és az artériás vírus NiRAN aktivitása a Mn2+-tól függ (16) (3C. ábra és SI függelék, S1. ábra).Az Mn2+-függőség és az UTP nyilvánvaló preferenciája a fehérje NMPilátorok szokatlan jellemzője, és csak nemrégiben erősítették meg a Salmonella typhimurium YdiU fehérjében, amely katalizálja a szigorú Mn2+-függő fehérje chaperon UMPylációt, hogy megvédje a sejteket a stressz indukciótól. 33).
A nemrégiben leírt szerkezeti hasonlóság a koronavírus NiRAN doménje és a celluláris protein kinázok között (17, 19) további támogatást nyújt a NiRAN azon képességéhez, hogy kovalensen kapcsolja össze az NMP-t más fehérjékkel, amelyekről ebben a tanulmányban beszámoltunk.A lehetséges NiRAN-célpontok keresését a HCoV-229E ORF1a által kódolt fehérjékre összpontosítottuk, amelyekről ismert, hogy közvetlenül vagy közvetve segítik az RTC ORF1b által kódolt replikázát (12, 35).Kísérleteink meggyőző bizonyítékot szolgáltatnak az nsp9 hatékony és specifikus NMPilációjára (2. ábra).Ha a célfehérjét olyan moláris feleslegben alkalmazzuk, amely 8-10-szer nagyobb, mint az enzimé (nsp12), akkor megerősíthető, hogy az nsp9 teljes mértékben (mono)NMP-vel rendelkezik (4. ábra).Arra a következtetésre jutottunk, hogy az nsp12 és nsp9 közötti kölcsönhatás rövid életű, és nem képez stabil komplexet az nsp9-cel (más RTC alegységek hiányában).Ezt a következtetést alátámasztják a SARS-CoV proteomon végzett fehérjekölcsönhatási vizsgálatok (35).Az MS analízis az nsp9 N-terminális aminosavának elsődleges aminját azonosította NMPilációs helyként (SI függelék, S5 ábra).A foszforamidát kötés és az N-terminális aminocsoport kialakulása különbözteti meg a NiRAN által közvetített NMPilációs aktivitást a Pseudomonas syringae SelO által közvetített AMPilációs reakciótól, amely katalizálja az O-kapcsolt AMP képződését a Ser, Thr vagy Tyr maradékainál Peptid adduktum ( 22), és a S. typhimurium YdiU O-kapcsolt (Tyr-rel) és N-kapcsolt (His-vel) peptid-UMP adduktokat képez.A SelO fehérjecsaládról rendelkezésre álló korlátozott információ azt jelzi, hogy ennek a nagy fehérjecsaládnak a tagjai nagymértékben különböznek a peptid-NMP adduktok képződésében.Ez egy érdekes megfigyelés, amely további tanulmányozást érdemel.
A tanulmányban kapott adatok alapján feltételeztük, hogy az nsp9 NMPilációjához szabad N-terminálisra van szükség.A vírusreplikáció összefüggésében ezt az nsp8|nsp9 feldolgozóhely proteolitikus hasítása biztosítja a pp1a replikáz poliproteinben, amelyet az Mpro és a pp1ab közvetít.A legtöbb koronavírusban ez a specifikus hely (HCoV-229E-ben VKLQ|NNEI) és az összes többi koronavírus Mpro hasítási hely között az a különbség, hogy az Asn (nem pedig egy másik kis maradék, például Ala, Ser vagy Gly) foglalja el a P1â-t???Helyszín (36).A korai vizsgálatok során kapott peptidhasítási adatok azt mutatták, hogy az nsp8|nsp9 hasítási hatékonysága alacsonyabb volt, mint más helyeké, ami azt jelzi, hogy 1) ennek a specifikus helynek szabályozó szerepe lehet a C-terminális időben összehangolt feldolgozásában. pp1a régió, vagy 2) a A speciálisan konzervált nsp9 N-terminális szerepe a vírus replikációjában (37).Adataink (5A. ábra) azt mutatták, hogy az nsp9 valódi N-terminális szekvenciát hordozó rekombináns formáját az nsp12 hatékonyan NMP-ezte.Az N-terminális szegélyező szekvenciát Xa faktor (nsp9-His6; SI függelék, S1 táblázat) vagy Mpro által közvetített hasítás (nsp7-11-His6; 5A. ábra és SI függelék, S1 táblázat) távolította el.Fontos, hogy a vágatlan nsp9-tartalmú nsp7-11-His6 prekurzor rezisztenciát mutatott az nsp12 NMPilációjával szemben, ami összhangban van adatainkkal, jelezve, hogy az nsp9-NMP addukt az N-terminális primer aminon keresztül jön létre (SI függelék, S5 ábra). .A NiRAN szubsztrát specifitásának mélyebb megértése érdekében ezután az nsp9 szomszédos N-terminális maradékaira összpontosítottunk.Más fehérjék hiányában szerkezetileg rugalmasak, megakadályozva, hogy az nsp9 jelöletlen formájában kimutathatóak legyenek (26 28, 38), jelezve korlátozott természetes variációjukat. Ennek oka a fontos szekvencia-specifikus (nem másodlagos szerkezettel kapcsolatos) Az nsp9 N-terminális fragmens funkciója.A konzervált aminosavak ala szubsztitúciói ebben a régióban (5C. és D. ábra és SI függelék, S8. ábra) azt mutatják, hogy az N3826 nélkülözhetetlen az nsp9 NMPilációhoz in vitro, míg az N3825A és E3827A szubsztitúciók az NMPiláció csökkenéséhez vezetnek, míg az M3829A és P3830A szubsztitúciók nem. .Nyilvánvalóan befolyásolja az nsp9 NMPilációt.Bár az N-terminális Asn (N3825A, N3825S) szubsztitúciója csak mérsékelt hatással van az nsp9 NMPilációjára és a vírusreplikációra sejttenyészetben (5C. és D. ábra), az N-terminális 3825-NN dipeptidből egy Asn-maradék szekvencia törlése Bebizonyosodott, hogy halálos a vírusokra, ami azt jelzi, hogy egy Asn-maradékra van szükség egy másik aminosav, előnyösen Asn előtt az N-terminálison, bár úgy tűnik, hogy a hasonló csoportok helyettesítése részben elviselhető (5B, C és D ábra).Arra a következtetésre jutottunk, hogy a 3825-NN dipeptid, különösen a konzervált és esszenciális N3826 aminosav a koronavírus tartományon belül (SI függelék, S6 ábra), biztosítja az nsp9 N-terminális megfelelő kötődését és orientációját a NiRAN aktív helyén.
Ha az összes alcsalád konzervált Glu-ját Ala-val (E3827A) helyettesítjük, az in vitro megtartja az nsp9 NMPilációt, de sejttenyészetben halálos a vírusokra (5C. és D. ábra), jelezve ennek a maradéknak a további funkcióját, például a kulcsfontosságú kölcsönhatásokban (NMPilált vagy módosítatlan). ) nsp9 N-terminálisa és a vírus replikációjában szerepet játszó egyéb tényezők.Az Nsp9 mutációk nem befolyásolták az nsp9 vagy bármely szomszédos nsps proteolitikus folyamatát (39) (SI Függelék, S9 ábra), ami arra utal, hogy számos megfigyelt nsp9 mutáció letális fenotípusát nem a C proteolitikus folyamat-terminális pp1a terület diszregulációja okozta. .
A fenti adatok bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a pp1a/pp1ab nsp8|9 hasítási helyének Mpro-közvetített kezelése után az nsp9 N-terminálisa UMPilezhető (vagy más NMP-vel részben módosítható).Ezenkívül az nsp9 N-terminálisának kiváló konzerválása (beleértve a koronavírus-családban található szinguláris és invariáns Asn-maradékokat) és az ebben a tanulmányban kapott fordított genetikai adatok (3E és 5D ábra) arra a következtetésre vezetett, hogy a leírt nsp9 NMPiláció biológiailag rokon és nélkülözhetetlen a koronavírus replikációjához.Ennek a módosításnak a funkcionális következményeit még tanulmányozni kell, például a korábban leírt (nem specifikus) nsp9 (módosítatlan forma) RNS-kötő aktivitást illetően (2628).Az N-terminális NMPiláció befolyásolhatja az nsp9 fehérje- vagy RNS-szubsztrátokkal való kölcsönhatását vagy különböző négyszintű összeállítások kialakulását is.Ezeket szerkezeti vizsgálatok során figyelték meg, és bebizonyosodott, hogy funkcionálisan összefüggenek a koronavírus replikációjával, bár különösen ennek hiányában (26- ââââââ29, 40).
Bár a koronavírus NiRAN doménjének célspecifitását még részletesebben jellemezni kell, adataink azt mutatják, hogy a koronavírus NiRAN doménjének fehérje célspecificitása nagyon szűk.Bár a kulcsfontosságú aktív hely maradékok (8, 16) konzerválása az összes nidovíruscsalád NiRAN doménjében erősen támogatja ezeknek a fehérjéknek a konzervált NMPylator aktivitását, a domén szubsztrátkötő zsebmaradékainak azonossága A konzerváció és a konzerváció még jellemezni kell. , és eltérő lehet a különböző Nidovirales családok között.Hasonlóképpen, más beágyazott vírusok releváns célpontjait még meg kell határozni.Lehetnek nsp9 vagy más fehérjék távoli ortológjai, mivel az öt replikáz doménen kívüli szekvenciák, amelyek általában konzerváltak a beágyazott vírusokban, kevésbé konzerváltak (8), beleértve az Mpro és a NiRAN közötti genomtömböt is. Ezek közül az nsp9 a koronavírus.
Ezenkívül jelenleg nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy a NiRAN tartomány további (beleértve a cellás) célokat is tartalmazzon.Ebben az esetben érdemes megemlíteni, hogy a feltörekvő fehérje NMPylatorok (NMPylators) bakteriális homológjai (30, 31) úgy tűnik, hogy „fő szabályozókkal” rendelkeznek?Az NMP számos sejtfehérjét modulál, hogy szabályozza vagy kiküszöbölje azok downstream aktivitását, ezáltal számos biológiai folyamatban játszik szerepet, például a celluláris stresszválaszban és a redox homeosztázisban (22, 33).
Ebben a vizsgálatban (2. és 4. ábra és SI függelék, S3 és S5. ábra) be tudtuk bizonyítani, hogy az nsp12 az UMP (NMP) részt egyetlen (konzervált) pozícióba vitte át az nsp9-ben, míg más fehérjék nem módosultak az nsp9-ben. használt Az adott körülmények között a jól meghatározott (nem laza) szubsztrát-specifitás támogatott.Ezzel összhangban az N-terminális nsp9 NMPilációhoz képest az nsp12 saját NMPilációs aktivitása nagyon alacsony, kimutatása hosszabb autoradiográfiás expozíciós időt igényel, és az nsp12 koncentráció 10-szeres növekedését alkalmazzák.Ezen túlmenően, MS elemzésünk nem szolgáltatott bizonyítékot az nsp12 NMPilációjára, ami arra utal, hogy a NiRAN domén ön-NMPilációja (a legjobb esetben) másodlagos aktivitás.Meg kell azonban jegyezni, hogy más tanulmányok előzetes bizonyítékot szolgáltattak arra vonatkozóan, hogy a bakteriális NMPylator ön-AMPilációs állapota szabályozhatja az NMPilációs aktivitásukat más fehérje szubsztrátokon (22, 33).Ezért további kutatásra van szükség az EAV nsp9-re (16) és a koronavírus nsp12-re (ez a tanulmány) jelentett ön-NMPilációs aktivitások lehetséges funkcionális hatásainak vizsgálatára, beleértve a javasolt chaperon-szerű hatást a C-terminális RdRp domén feltekeredésére. 16) ).
Korábban több hipotézist is figyelembe vettek a nidovírus NiRAN doménjének lehetséges downstream funkcióival kapcsolatban, ideértve az RNS-ligázt, az RNS-zárolt guanilát-transzferázt és a fehérje priming aktivitást (16), de ezek egyike sem kompatibilis a rendelkezésre álló downstream funkciókkal.A következő pozíciókban nyert információ pontosan ugyanannyi időre vonatkozik, további feltételezések nélkül.Az ebben a tanulmányban kapott adatok leginkább összhangban állnak azzal (de nem tudják bizonyítani), hogy a NiRAN domén részt vesz a fehérje által indukált RNS szintézis beindításában.Korábban azt hitték, hogy a NiRAN tartomány funkciója az 5??A ²-RNS-záró vagy RNS-ligálási reakciókat ezek és egyéb adatok nem befolyásolják.Ezért például úgy tekintjük, hogy a NiRAN aktív helye a konzervált Asp-t tartalmazza általános bázisként (D252 a Pseudomonas syringae SelO-ban; D4271 a HCoV-229E pp1ab-ban; D208 a SARS-CoV-2 nsp12-ben) (SI függelék, 2. ábra) ).S2) (17, 22, 33), míg az ATP-függő RNS-ligázban és az RNS-záró enzimben a katalízist a kovalens enzim (lizil-N)-NMP intermedier végzi, amely egy nem-változott Lys-maradékot foglal magában ( 41).Ezenkívül a koronavírus NiRAN figyelemreméltó szekvencia-alapú specifitása a konzervált fehérjecélpontokra és az NTP társszubsztrátokra vonatkozó laza specifitása (előnyben részesíti az UTP-t) ellenzi a NiRAN által közvetített záró enzim vagy RNS-ligáz-szerű funkciókat.
Nyilvánvalóan sok többletmunkára van szükség az nsp9-UMP (nsp9-NMP) fehérje által indukált RNS-szintézisben betöltött lehetséges szerepének igazolására, és ha bebizonyosodik, kidolgozására, amely számos érdekes, de (eddig) korábban közölt jelentést összekapcsol majd. .Elszigetelt megfigyelések.Például megállapították, hogy a koronavírus negatív szálú RNS-ének vége egy oligo(U) szállal kezdődik (42, 43).Ez a megfigyelés összhangban van azzal az elképzeléssel, hogy a negatív szálú RNS szintézisét az nsp9 UMPilált formájának a poli(A) farokhoz (triggerek) való kötődése indítja be, amit az RNS-kötés elősegíthet. egy másik RTC fehérje.Az nsp9 által biztosított UMP-rész ezután „primerként” használható az nsp7/8/nsp12-mediált oligouridilációhoz, a genomiális RNS-ben a 3??2-poli(A) farok vagy egy másik oligo (A)-tartalmú szekvencia felhasználásával. templátként szolgál, hasonlóan a picornavírus VPg fehérjére létrehozott mechanizmushoz (44).Mi van akkor, ha a javaslat „nem normatív”????A (fehérje által indukált) negatív szálú RNS szintézis beindulása linket ad a megfigyelésekhez, jelezve, hogy a koronavírus negatív szálú RNS végén UMP van (UTP helyett) (42), ami azt jelzi, hogy A Dicer nukleinsav egy ismeretlen uridin-specifikus endonukleáz által foszforilált véget hasítja.Ha megerősítik, ez a nukleinsav hidrolitikus aktivitás segíthet az nsp9 oligomer UMPilált formájának felszabadításában a születőben lévő negatív szál 5 ²-es végéről.Az nsp9 lehetséges szerepe a fehérje primingben szintén összhangban van a korábbi fordított genetikai vizsgálatokkal, amelyek kimutatták, hogy az nsp9 (és nsp8) kritikusan és specifikusan kölcsönhatásba lép a koronavírus genomjának 3. végének közelében lévő konzervált cisz-hatású RNS-elemmel.45).A jelentés szerint ezek a korábbi megfigyelések most újra megvizsgálhatók és további kutatásokkal bővíthetők.
Összefoglalva, adataink meghatározták egy szabadalmaztatott, beágyazott vírusenzim-tag specifikus aktivitását, amely az RdRp-hez kapcsolódik az N-terminálison.A koronavírusban ezt az újonnan felfedezett NiRAN által közvetített UMPylator/NMPylator aktivitást arra használják, hogy Mn2+-ra és a szomszédos Asn-maradékokra támaszkodjon, és (alacsony energiájú) foszforamidát kötések képződését okozza az N-terminális primer aminnal.Az nsp8|9 hasítási helyen végzett Mpro által közvetített hasítás révén az nsp9 célpont felhasználható NMPilációhoz, jelezve a proteáz és a NiRAN domén közötti funkcionális kapcsolódást, amely az RdRp-ig terjed.Az nsp12 NiRAN aktív helyén és az nsp9 célpontjában lévő kulcsfontosságú maradékok konzerválása két koronavírusból, köztük a SARS-CoV-2-ből származó adatokkal kombinálva erős bizonyítékot szolgáltat arra vonatkozóan, hogy az nsp9 NMPiláció egy koronavírus.A rendelkezésre álló adatok arra engednek következtetni, hogy az nsp9 NMPilált formájának specifikus szerepe a fehérje által indukált RNS szintézisben ésszerű forgatókönyv a koronavírus és más beágyazott vírusok számára, és a NiRAN más azonosítatlan fehérjéket is megcélozhat.Szabályozza a vírust.Host interakció.Ha bebizonyosodik, a fehérje primerek részvétele a vírus RNS szintézisében növeli az Mpro/3CLpro és RdRp domének szekvencia affinitását a korábban kimutatott koronavírus és pikornavírus-szerű szupercsoport között (9), amelyeket mára a közelmúltban létrehozott Pisoniviritesben egyesítettek. 46) kategóriában.
Adataink azt is mutatják, hogy a jelen tanulmányban azonosított alapvető, szelektív és konzervatív enzimaktivitások felhasználhatók vírusellenes gyógyszerek célpontjaiként.Azokból a vegyületekből, amelyek megzavarják a konzervált nsp9 N-terminális kötődését (és az azt követő módosítást) a NiRAN aktív helyén, hatékony és sokoldalú vírusellenes gyógyszerekké fejleszthetők, amelyek alkalmasak különböző (al)nemzetségbeli fertőzésekből származó állati és humán koronavírusok kezelésére. ideértve a SARS-CoV-2-t és a Közel-Kelet légúti szindróma koronavírusát.
Az ebben a vizsgálatban előállított koronavírus-fehérje kódolószekvenciáját RT-PCR-rel amplifikáltuk HCoV-229E-vel fertőzött Huh-7-ből vagy SARS-CoV-2-vel fertőzött Vero E6-ból izolált RNS felhasználásával, és standard klónozási eljárásokkal inszertáltuk.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) vagy pASK3-Ub-CHis6 (47) expressziós vektor (SI Függelék, S1 és S2 táblázatok).Egyetlen kodonszubsztitúciót PCR-alapú helyspecifikus mutagenezissel vezettünk be (48).Az MBP fúziós fehérje előállításához E. coli TB1 sejteket transzformáltunk a megfelelő pMAL-c2 plazmid konstrukcióval (SI függelék, S1 táblázat).A fúziós fehérjét amilózaffinitás-kromatográfiával tisztítottuk, és Xa faktorral hasítottuk.Ezt követően a C-terminális His6-jelölésű fehérjét Ni-immobilizált fémaffinitáskromatográfiával (Ni-IMAC) tisztítottuk a korábban leírtak szerint (49).Az ubiquitin fúziós fehérje előállításához az E. coli TB1 sejtek a megfelelő pASK3-Ub-CHis6 plazmid konstrukciót (SI függelék, S1 és S2 táblázatok) és az ubiquitin-specifikus C-terminális hidroláz 1-et (Ubp1) kódoló pCGI plazmid DNS-t használták.Átalakulás (47).A C-terminális His6-jelölésű koronavírus-fehérjét a korábban leírtak szerint tisztítottuk (50).
A HCoV-229E nsp12-His6 ön-NMPilációs tesztjét az EAV nsp9-ben leírtak szerint végeztük (16).Röviden, az nsp12-His6 (0,5 µM) 50 mM 4-(2-hidroxi-etil)-1-piperazin-etánszulfonsavat (HEPES)-KOH-t, pH 8,0, 5 mM ditiotreitolt (DTT), 6 mM MnCl2-t, 25 µM puffert tartalmaz. a megadott NTP és 0,17 µM megegyezett az [α32-P]NTP-vel (3000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30 °C-on 30 percig.Az nsp12-közvetített nsp9 NMPiláció összes többi (standard) NMPilációs vizsgálatában a reakciókörülményeket a következőképpen állítjuk be: nsp12-His6 (0,05 µM) és nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH 8) jelenlétében. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 uM jelzett NTP, és 0,17 uM megfelelő [a32-P]NTP.30 °C-on 10 percig tartó inkubálás után a reakciómintát SDS-PAGE mintapufferrel kevertük össze: 62,5 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% glicerin és 0,005% brómphenol. kék.A fehérjét 90 °C-on 5 percig tartó melegítéssel denaturáltuk, és 12%-os SDS-PAGE-val elválasztottuk.A gélt fixáljuk és Coomassie Brilliant Blue oldattal (40% metanol, 10% ecetsav, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250) megfestjük, színtelenítjük, és 20 órán át foszforeszkáló képernyőn tesszük ki (az nsp12 kimutatására NMPilációból). vagy (maximum) 2 óra (az nsp9 NMPiláció értékeléséhez).Typhoon 9200 képalkotó készüléket (GE Healthcare) használtak a képernyő szkennelésére, az ImageJ-t pedig a jelintenzitás elemzésére.
Az MS analízishez 1 µM nsp12-His6-ot és 10 µM nsp9-et (hexahisztidin tag nélkül) használtunk az NMPilációs analízisben (SI függelék, S1 táblázat), és a megnövekedett 500 µM UTP és GTP koncentrációt alkalmaztuk.Koncentrációjuktól és várható fehérjeminőségüktől függően egy MassPrep oszloppal (Waters) felszerelt Waters ACQUITY H-Class HPLC rendszert használtunk 1-10 µl pufferolt fehérjeoldat online sómentesítésére.A sómentes fehérjét a Synapt G2Si tömegspektrométer (Waters) elektropermet ionforrásába eluáljuk az A puffer (víz/0,05% hangyasav) és B puffer (acetonitril/0,045% hangyasav) gradiensén keresztül, és az oszlop hőmérséklete: 60 °C és 0,1 ml/perc áramlási sebesség: izokratikus elúció 5% A-val 2 percig, majd lineáris gradiens 95% B-ig 8 percen belül, és 95% B fenntartása további 4 percig.
500-5000 m/z tömegtartományú pozitív ionokat detektálunk.A glu-fibrinopeptid B-t 45 másodpercenként mérik az automatikus tömegsodródás korrekció érdekében.Használja a MassLynx műszerszoftvert MaxEnt1 kiterjesztéssel az átlagos spektrum dekonvolúciójához az alapvonal és a simítás levonása után.
Az UMPilált HCoV-229E nsp9-et szekvenálási minőségű módosított tripszin (Serva) hozzáadásával emésztettük, és egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk.Chromabond C18WP spin oszlopot (cikkszám: 730522; Macherey-Nagel) használtunk a peptidek sómentesítésére és koncentrálására.Végül a peptidet feloldottuk 25 µl vízben, amely 5% acetonitrilt és 0,1% hangyasavat tartalmazott.
A mintákat MS elemeztük Orbitrap Velos Pro tömegspektrométerrel (Thermo Scientific).A végső nanoa HPLC rendszer (Dionex), egyedi végre szerelt 50 cm-es ??75 μm-es C18 RP oszlop 2,4 μm-es mágneses gyöngyökkel (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Csatlakoztassa a tömegspektrométerhez online a Proxeon nanospray forráson keresztül;fecskendezzen be 6 µL tripszin emésztőoldatot egy 300 µm belső átmérőjű ×??1 cm-es C18 PepMap előkoncentrációs oszlop (Thermo Scientific).Oldószerként vizet/0,05% hangyasavat használva a mintát automatikusan felfogtuk és sótalanítottuk 6 µl/perc áramlási sebességgel.
A következő gradienseket alkalmaztuk: víz/0,05% hangyasav (A oldószer) és 80% acetonitril/0,045% hangyasav (B oldószer) a triptikus peptidek elválasztásához 300 nl/perc áramlási sebesség mellett: 4% B 5 perc, majd 30 A lineáris gradiens 45% B-ig perceken belül, és lineáris növekedés 95% B oldószerig 5 percen belül.Csatlakoztassa a kromatográfiás oszlopot egy rozsdamentes acél nano-emitterhez (Proxeon), és permetezze az eluenst közvetlenül a tömegspektrométer fűtött kapillárisára 2300 V-os potenciál használatával. Az Orbitrap tömeganalizátorban 60 000-es felbontású felmérési pásztázáshoz kapcsolódik. legalább három adattal MS/MS pásztázás, dinamikusan kizárva 30 másodpercig, lineáris ioncsapda ütközéssel indukált disszociációval vagy nagyobb energiájú ütközési disszociációval kombinálva orbitrap detektálással , A felbontás 7500.
Feladás időpontja: 2021. augusztus 03